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染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)

发布时间:2011-04-30 21:38:00点击次数: 作者:

真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在(Figure1)。因此,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation ,简称ChIP) 是一种在体内研究DNA 和蛋白质相互作用的方法,在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来,这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

 

Figure 1: 染色质结构

 

     染色质免疫沉淀技术的原理是 在生理状态下把细胞内的DNA 与蛋白质交联在一起,超声波将染色质打碎后,用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息(Figure 2)。

1. 1  细胞的甲醛固定

甲醛(formaldehyde) 是一种高分辨率(2 A) 的可逆的交联剂,能有效的使蛋白质-蛋白质蛋白质-DNA ,蛋白质-RNA 交联。其原理为 在甲醛的作用下DNA 碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的α氨基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA 和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起,在几分钟内形成生物复合体( biopolymers) 防止细胞内组分的重新分布而且,甲醛并不作用于游离的双链DNA 从而避免DNA 的损伤。特别是,甲醛交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中分别对DNA 和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度约为1 % 而交联时间需要预实验来确定。这是因为交联时间过长则实验材料易丢失且交联后的DNA-蛋白质复合体难以用超声打断;交联时间过短 则交联不完全。通常的交联时间为5 min1 h 可以随时加入甘氨酸来终止交联反应。

1. 2  超声波断裂染色质

 

Figure2: 染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitationChIP)方法程序

 

甲醛交联后的染色质对限制酶和DNase I 高度抵抗,因此通常使用机械剪切力使得染色质断裂。打断后的染色质片段的平均长度应该在5001 000bp 左右(可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定) 。染色质片段的平均长度对于蛋白质在DNA 上结合位点的高分辨率作图非常重要。

1. 3  染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化

用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀。抗体的量要进行优化,防止非特异的结合。用Protein A/ G Agarose/ Sepharose 回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质后1 %SDS + NaHCO3 洗脱免疫沉淀复合体。

1. 4  交联反应的逆转和DNA 的纯化

在免疫沉淀复合体中加入不含DNase RNase Proteinase K(也可以不加蛋白酶K交联逆转后用QIAquick DNA cleanup system 回收DNA ,蛋白还可用于做进一步的析) 65 保温 6 h 使交联逆转。经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。纯化的DNA 极少可用色谱定量。

1. 5  染色质免疫沉淀的DNA 的分析和蛋白质在DNA 上结合位点的鉴定

染色质免疫沉淀的DNA 的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列可以采用狭缝杂交和PCR 分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的( high throughput ) 研究目的蛋白在基因组上的分布情况找出反式作用因子的结合位点可以采用Sout hern 杂交、ChIP 克隆和DNA芯片方法。

 

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