蛋白印迹（Western blotting，WB）

蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是检测蛋白的重要方法之一。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 

（一） 蛋白样品的制备

可以选用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。在微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。以充分变性蛋白。使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。

（二）SDS-PAGE电泳

1. SDS-PAGE凝胶配制

（1）取出玻璃板，用自来水洗净后，蒸馏水冲洗一次，置37 度烘干或晾干（戴手套操作），梳子应用水洗净，临用前用乙醇擦拭，挥发至干。组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上，确保不漏胶。

（2）按表1配制分离胶液体并脱气，其中AP和TEMED灌胶前再加入，轻轻摇匀，以免产生气泡。

表1  凝胶的制备

按所需分离的蛋白质分子大小配制合适浓度的凝胶（表2），将凝胶溶液平稳地注入两层玻板中（以平稳流速从垫片的边缘注入），缓慢持续注入至液面距梳齿2-3厘米处，再在液面上小心注入一层水饱和异丁醇（厚约1cm），以隔绝空气，静置直至凝胶的形成（聚合后，可见在异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线）。

表2  SDS-PAGE凝胶的有效分离范围

（3）倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。按表1配制积层胶液体，以连续平稳的流速在分离胶上面注入浓缩胶液至玻板顶端，然后立即小心的插入梳子。必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间，室温聚合30min。

2.上样与电泳

（1）待浓缩胶完全聚合后，取下梳子，用1×SDS电泳缓冲液洗涤加样槽，以除去未聚合的丙烯酰胺，然后取下夹子、以及环绕在玻板周围的乳胶条，注意不要改变玻板的相对位置。
（2）在电泳槽上下即两侧电极槽中注入电泳缓冲液，注意缓冲液与凝胶上下两端之间不要有气泡。气泡可用尖端弯曲的滴管排出。

（3）用微量上样器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层。对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20µl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50µg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10µg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20µl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。对照孔加入蛋白质分子量标准样品，为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准 。如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。

（4）再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。

（5）连接电源，电泳时通常在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可设置在120V左右。采用普通的电泳仪就可以满足SDS-PAGE电泳的要求，为方便起见，也可整个SDS-PAGE电泳过程均采用恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定时间为90~120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过冲。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白的电泳位置。（6）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。卸下玻板，放在纸巾上，撬开玻板。紧靠最左边一孔凝胶上部切除一角以标注凝胶的方位。

（三）转膜——半干式转移

在Western实验中，常用的转印膜有PVDF膜和硝酸纤维素膜(NC膜)（表3 ）。PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡。在转移槽的阳极板上按以下顺序放置下物：浸过缓冲液的3张滤纸、膜、 凝胶、浸过缓冲液的3张滤纸，盖上负极盖，恒电流1.5-2 mA，电压不要超过25伏通电1-2小时，胶中的蛋白质将转移至膜上。120kDa以上高分子量蛋白质，用此法的转移效率不高，可采用湿转法。 转膜时，具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察，也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。或者用考马斯亮蓝染色液对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。膜可用免疫显色法显色，也可密闭于袋中置-20度保存。

表3  几种膜的特点

（四）封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的PBST中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起，以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。可用巴斯特吸管吸尽洗涤液，将膜放入杂交袋中，根据膜面积以0.1ml/cm²量加入WB封闭液，尽可能排尽气泡，然后密闭袋口，在水平摇床上缓缓摇动，室温封闭1-2小时。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。

（五）一抗孵育

用封闭液将一抗适当稀释（1：400-3000），将已封闭的膜置抗体溶液（溶液量根据膜面积以0.1ml/cm²计算）中，排尽气泡，密闭袋口室温缓缓摇动1-3小时或4度过夜。将膜转移至浅托盘中，用漂洗液（PBST）振摇洗3-5次，每次5-10分钟。

（六）二抗孵育

用封闭液将二抗1：200-2000稀释，将膜置抗体溶液（溶液量根据滤膜面积以0.1ml/cm²计算）中，室温缓缓摇动1-2小时。将膜转移至浅托盘中，用漂洗液（PBST）振摇洗3-5次，每次5-10分钟。

（七）蛋白检测

目前常用的显影方法有ECL化学发光法和DAB显色法。具体使用细节可参考相关产品说明书。

（八）膜的重复利用

 如果蛋白样品非常宝贵，可以使用WB抗体去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。